El mundo microscópico

Al igual que nosotros, cada célula que forma nuestro cuerpo puede crecer, reproducirse, procesar información, responder a estímulos y llevar a cabo una gran variedad de reacciones químicas. Estas habilidades definen la vida. Nosotros y otros organismos multicelulares contenemos miles de millones o billones de células organizadas en estructuras complejas, pero muchos organismos sólo son una simple célula y, aun así, exhiben todas las propiedades que distinguen a lo viviente. De esta manera, se considera que la célula es la unidad fundamental de la vida y por eso es tan importante entender cómo funciona, investigar sus componentes, conocer cómo son las estructuras que contienen y saber cómo ellas se contactan y se relacionan entre sí. El problema radica en el hecho de que su tamaño es muy pequeño (Tabla 1). El ojo humano, en condiciones óptimas y de acuerdo a determinaciones ópticas, solo distinguirá elementos cuyo diámetro sea mayor a 0,1 mm.

Tabla1 : Tamaño celular

Recordar que 1 μm = 0,001 mm

Figura 1: Poder resolutivo del microscopio

Como podemos observar (Figura 1), para llegar a visualizar diferentes niveles de organización biológica se necesita de instrumentos y técnicas que permitan magnificar la imagen. En este sentido, existen diversos equipos auxiliares que pueden ayudarnos a ampliar el rango que podemos observar:

Lupas estereoscópicaso Estereomicroscopio:

Este tipo de instrumento permite visualizar ciertos detalles de organismos o estructuras macroscópicas. Como se observa en la figura 2, la lupa binocular consta de dos microscopios completos, cada uno con su objetivo y ocular, en los que, al no coincidir sus ejes ópticos, las imágenes formadas en los oculares son distintas. Lo mismo ocurre con la visión ocular, por lo que vemos una imagen en tres dimensiones.

Pasos para lograr un buen enfoque en estereomicroscopios:

1-Ajustar la luz incidente para proporcionar una iluminación uniforme sobre la placa.
2-Ajustar los oculares a la separación entre los ojos.
3-Colocar la muestra a observar sobre la placa de contraste en la platina. Elegir la placa de contraste del color que realce la observación.
4.-Enfocar mediante el tornillo macrométrico, usando sólo el ojo izquierdo. Y, usando el ojo derecho, enfocar la imagen moviendo el anillo de ajuste de visión personal. Después observe con los dos ojos.
6.-El aumento se cambia, cuando es necesario, mediante modificación del zoom.

El aumento de la lupa se calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento que indica el tambor de cambio (zoom).

Microscopio óptico común:

El microscopio óptico (Figura 3), a diferencia de la lupa estereoscópica, se utiliza para visualizar tejidos, células e incluso estructuras subcelulares.

Figura 3: Partes del microscopio óptico

Este instrumento cuenta con tres sistemas:

1-Sistema mecánico

· Pie o Base: Proporciona el apoyo del instrumento.

· Platina: es una superficie plana perpendicular a la columna, con un orificio central para la entrada de luz, en donde se colocará el portaobjeto con la muestra. Cuenta además con un juego de pinzas que sujetan y permiten desplazar el portaobjeto en dos direcciones: hacia adelante y atrás o hacia la izquierda y derecha del observador.

· Mando de acomodación: formado por dos botones o tornillos denominados:
-Macrométrico: permite un ajuste grueso con movimientos amplios de la platina.
-Micrométrico: permite un ajuste fino con movimiento inapreciable de la platina, a nivel de micrones, logrando una imagen nítida del preparado.
Ambos permiten lograr el enfoque.

2- Sistema Lumínico

· Bombilla de bajo voltaje: fuente de luz.

· Transformador: reduce la tensión de la red eléctrica al requerido por la bombilla. Ambos pueden estar fijos o no al pie del instrumento.

· Potenciómetro: regula la intensidad de la iluminación.

· Diafragma: asociado a la platina, es una membrana que se abre o se cierra, y cuya función es eliminar los rayos periféricos que forman imágenes distorsionadas.

3- Sistema óptico

· Condensador: compuesto por una lente o sistema de lentes que tienen por finalidad hacer eficiente la iluminación, de manera tal que la mayor parte de los rayos atraviesen el preparado y entren en el sistema óptico propiamente dicho. Se mueve en el sentido vertical por medio de una cremallera. En posiciones altas, concentra los rayos en un punto (disminuye el ángulo de apertura de los rayos lumínicos).

· Sistema Óptico propiamente dicho que consta básicamente de dos sistemas de lentes: ocular y objetivo, separados por una distancia fija.
-Lentes Oculares: son las lentes más cercanas al ojo del observador, se hallan montadas en un tubo (monocular) o dos tubos (binocular), cilíndrico, hueco y negro en su interior, para evitar la reflexión de la luz. Esta lente lleva impreso el número de aumentos.
-Lentes Objetivos: es la lente más cercana a la muestra a observar. Existen cuatro objetivos montados sobre un Revolver Porta-objetivos que tienen distintos aumentos: 5X, 10X, 40-50X y 90-100X. Los tres primeros se denominan lentes secas y la última, lente de inmersión porque se debe sumergir en aceite de cedro u otro medio cuyo índice de refracción sea aproximadamente igual al del vidrio. Esta lente tiene un punto de enfoque muy próximo al portaobjeto, de esta manera, el aceite de cedro, que posee un índice de refracción igual a 1,52, impide la desviación de los rayos luminosos al pasar de un medio a otro.

-Aumento: es la relación entre el tamaño de la imagen obtenida de un objeto y el tamaño real del mismo. El aumento total real resulta de multiplicar el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Ejemplo: Objetivo 40X y Ocular 10X significa que la imagen está 400 veces aumentada.

¿Qué podemos observar en el microscopio óptico?

Un microscopio funciona correctamente debido a que los rayos luminosos atraviesan la muestra y nos dan una imagen. Una buena observación al microscopio óptico exige un espesor de la muestra de alrededor de los 10 micrones o menos. Si la muestra es más gruesa, los planos celulares superpuestos impiden el paso de la luz y las imágenes resultan confusas. Este es el motivo por el cual debemos acondicionar la muestra elaborando un preparado. Hay distintos tipos de preparados (no permanentes, semi permanentes y permanentes), veamos cómo se realiza cada uno.

Indicaciones para llevar a cabo los preparados:

Más detalles sobre la coloración: se utilizan colorantes que en su mayoría son orgánicos y con estructura semejante al benceno o a sus derivados, que al unirse específicamente a algún componente celular lo resaltan o diferencian respecto del resto de la estructura o matriz. Su acción ocasiona que las estructuras celulares dejen de funcionar normalmente, quitándole las propiedades de vida. Los colorantes se combinan con las diferentes estructuras por afinidad química:
-Las sustancias ACIDAS se tiñen con colorantes básicos. Ej. Fucsina Básica, Safranina, Verde de Metilo y Azul de Metileno.
-Las sustancias BÁSICAS son afines a colorantes ácidos. Ej. Fucsina ácida, Rojo Congo.

Para tener en cuenta sobre la fijación: consiste en provocar la muerte rápida de la célula tratando de mantener intacta su morfología y composición química. Impide que se produzcan los procesos de descomposición y también permite que los microorganismos y las células queden adheridos a la superficie del portaobjeto. Algunos agentes fijadores son: calor, congelamiento, metanol, entre otros.

Una vez que realizamos el preparado de la muestra, pasamos al microscopio. Hay una serie de pasos que deben llevarse a cabo para lograr un buen enfoque:

1. Colocarse sentado con la posición descansada del cuerpo, esto posibilita el trabajo cómodo.

2. Sujetar el preparado sobre la guía portaobjeto de la platina utilizando las pinzas. Verificar que el preparado esté hacia arriba.

3. Conectar la fuente de luz, ubicar una mano sobre el tornillo macro-micrométrico, y la otra mano en los comandos de las guías de los portaobjetos.

4. Para la primera observación se debe utilizar el objetivo de menor aumento (10X). Éste dará una visión integral del preparado y permitirá elegir las mejores áreas, para luego observar en mayor aumento. Al seleccionar el objetivo, no tocar con los dedos las lentes de los objetivos.

5. Seleccionar la iluminación correcta. El condensador se utiliza en posiciones intermedias a bajos aumentos y en posiciones superiores con el objetivo de inmersión.

6. El enfoque correcto del preparado se realiza girando el tornillo macro-micrométrico, ajustando la imagen del campo, moviendo la platina hacia arriba y hacia abajo.

7. El tubo binocular se ajusta con ambas manos a la distancia interpupilar del operador, hasta observar una sola imagen.

8. Recordar que al emplear el objetivo de inmersión, se utiliza con una gota de aceite de inmersión entre el preparado y la lente. Se deben evitar la formación de burbujas de aire en la gota de aceite. Luego de utilizado el objetivo, se debe limpiar con algodón o paño seco.

Otros microscopios profesionales.

Nos concentramos en los microscopios más conocidos en el laboratorio, pero también existen otros que son más costos y con tecnología más avanzadas. Estos realizan un gran aporte a la hora de realizar estudios más específicos sobre la muestra:

Microscopio de fluorescencia: puede detectar la autofluorescencia de ciertas moléculas o también se utiliza con sustancias marcadas con fluorocromos. Esto permite que se llevan a cabo estudios de localización celular, detección de interacciones entre células, diferenciación entre viables y no viables, estudios de procesos internos como endocitosis y exocitosis, entre otros.

Microscopio electrónico: logra obtener una amplificación aún mayor de la muestra ya que permite observar con mayor detalle algunos orgánulos, membranas, estructuras citosólicas, complejos moleculares de la matriz extracelular y virus.

Actividad

Ahora que sabemos la importancia que tiene conocer las células y cómo podemos llegar a observarlas, vamos a utilizar los microscopios de laboratorio que explicamos para reconocerlas y diferenciar sus estructuras.

Cada vez que se utiliza el microscopio, se dibuja lo que se observa y se hacen anotaciones sobre la forma, el tamaño, el color y las estructuras que se visualizan.

Bibliografía:

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